Construido por Antonio Sillero y posteriormente por Juan Bautista de Toledo entre 1559 y 1564 como monasterio de las Clarisas, ocupa el antiguo palacio donde residieron Carlos I e Isabel de Portugal y donde nació, en 1535, su hija doña Juana, posterior fundadora del convento. Ella misma está sepultada en una capilla, con escultura funeraria orante realizada por Pompeyo Leoni.